Sáng kiến kinh nghiệm Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh tại tỉnh Vĩnh Phúc

 SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VĨNH PHÚC
 TRƯỜNG THPT NGUYỄN THỊ GIANG
 
BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, ỨNG DỤNG SÁNG KIẾN
Tên sáng kiến kinh nghiệm: “ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÒNG 
LÚA CHỌN LỌC THẾ HỆ R2 CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ 
 SẸO CHỊU LẠNH TẠI TỈNH VĨNH PHÚC”
 Tác giả sáng kiến: Dương Thị Thu Huyền
 Mã sáng kiến : 25.56
 Vĩnh Phúc, năm 2019
 i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
2,4D 2,4D –dichlorphenoxyacetic acid
ABA Abscisic acid
DNA Deoxyribo nucleic acid
BAP 6 – Benzyl amino purin
bp Cặp base
cs Cộng sự
ĐC Đối chứng
ĐVHĐ Đơn vị hoạt độ
EDTA Ethylen diamin tetra axetic acid
FAO Food Agriculture Orgnization
kb Kilobase
KLK Khối lượng khô
mRNA ARN thông tin
PCR Phản ứng chuỗi polymerase
TAE Tris axetat EDTA
XCH Xuân Châu Hương
 iii DANH MỤC HÌNH
Hình Tên Hình Trang
 3.1 Các dòng chọn lọc R2 có nguồn gốc từ giống C27 20
 3.2 Các dòng chọn lọc R2 có nguồn gốc từ giống XCH 21
 Các dòng chọn lọc R3 ở giai đoạn mạ ở thời điểm 
 3.3 28
 trước trước và sau khi xử lý bởi lạnh
 3.4 Kết quả tách chiết DNA tổng số của 2 mẫu lúa 36
 3.5 Kết quả nhân gen osDREB1F của 2 mẫu lúa 37
 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 
 3.6 38
 E.coli DH5α
 3.7 Kết quả conoly PCR từ các dòng khuẩn lạc trắng 39
 Kết quả tách chiết plasmid của các dòng khuẩn mang 
 3.8 40
 vector tái tổ hợp
 Kết quả cắt plasmid của các dòng khuẩn mang vector 
 3.9 41
 tái tổ hợp
 v Việt Nam hàng năm ở các tỉnh vùng núi phía Bắc, miền núi trung du đồng 
bằng sông hồng trong đó có tỉnh Vĩnh Phúc luôn có mùa đông lạnh giá. Nhiệt độ 
có năm xuống đến mức rét đậm, rét hại không đảm bảo cho cây lúa sinh trưởng 
tốt, làm ảnh hưởng không nhỏ đến năng suất, chất lượng và sản lượng xuất khẩu 
cuối năm.
 Đứng trước những khó khăn thách thức đó, năm 2012 tôi đã nghiên cứu 
và bảo vệ thành công đề tài luận văn thạc sĩ về “Đánh giá một số dòng lúa chọn 
lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu lạnh”, bước đầu chọn lọc được một 
số dòng lúa thế hệ R2 cho thế hệ R3 đạt kết qủa tốt về khả năng chịu lạnh ở các 
tỉnh miền núi phía Bắc. Trong quá trình công tác tại tỉnh Vĩnh Phúc tôi nhận 
thấy vào vụ đông xuân cây lúa cũng chịu ảnh hưởng không nhỏ bởi điều kiện 
lạnh giá như ở các tỉnh miền núi phía bắc, những đợt rét đậm, rét hại làm ảnh 
hưởng nghiêm trọng đến sản lượng lúa hàng năm của tỉnh.
 Xuất phát từ những lý do trên tôi đã tiếp tục tiến hành nghiên cứu đề 
tài:“Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo 
chịu lạnh tại tỉnh Vĩnh Phúc”
2. TÊN SÁNG KIẾN
Đánh giá một số dòng lúa chọn lọc thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu 
lạnh tại tỉnh Vĩnh Phúc.
3. TÊN TÁC GIẢ:
 - Họ và tên: DƯƠNG THỊ THU HUYỀN
 - Địa chỉ: Trường THPT Nguyễn Thị Giang – Đại Đồng – Vĩnh Tường – 
Vĩnh Phúc.
 - Số điện thoại: 0985123340 E_mail: duongthithuhuyen83@gmail.com
4. CHỦ ĐẦU TƯ:
 Dương Thị Thu Huyền giáo viên giảng dạy môn Sinh học trường THPT 
Nguyễn Thị Giang.
 2 Bảng 2.1. Đặc điểm của các giống lúa nghiên cứu
 Thời gian sinh Chiều cao Khối lượng
 Giống Số hạt chắc/bông
 trưởng (ngày) cây (cm) 1000 hạt (g)
 C27 100 90 90 - 95 hạt 20- 21
 U17 145 - 150 95 - 100 100 hạt 26 - 27
 XCH 100 80 - 85 125 - 135 hạt 27 - 28
 Bảng 2.2. Các dòng thế hệ R2
 STT Dòng chọn lọc Nguồn gốc
 1 R2.03, R2.08, R2.16, R2.18 C27
 2 R2.01, R2.04, R2.05, R2.09, R2.11 U17
 3 R2.06, R2.13, R2.20, R2.38, R2.44 XCH
7.3.1.2. Hoá chất và thiết bị
 - Hoá chất: Các hóa chất dùng trong nghiên cứu có nguồn gốc từ Anh 
Đức, Mĩ Trung Quốc gồm: EDTA, Tris-HCl , Acid acetic, X-gal, Kanamycin, 
Ampicilin, Agar; Agarose (Sigma, Mỹ), cồn tuyệt đối, bộ kit dùng cho phản ứng 
PCR, kit tách dòng, bộ kit sử dụng tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp, các loại 
enzym giới hạn: EcoRI, BamHI, NotI . Tế bào E. coli thuần chủng DH5α, 
photphat citrat, petroleum ether
 - Thiết bị: Cân điện tử santorius, tủ sấy carbolite, máy quang phổ 
Uvis Cintra 40, máy li tâm lạnh Hettich, nồi hấp cao áp, box cấy, máy PCR 
system 9700 (Pharmacia), máy điện di (Biorad), máy đo quang phổ Diode 
Array Spectrophotometer, máy ổn định nhiệt, máy soi UVcó nguồn gốc 
từ Anh, Đức.
7.3.1.3. Địa điểm nghiên cứu
 - Các thí nghiệm đồng ruộng được tiến hành ở vụ mùa năm 2017 tại xã 
Đại Đồng, huyện Vĩnh Tường, tỉnh Vĩnh phúc.
 4 B: Khối lượng mẫu sau khi đem phân tích (mg).
 • Xác định hàm lượng protein tan theo phương pháp Lowry được mô tả 
trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs (1998) [4].
 Các bước tiến hành như sau:
 (1) Cân 0,05g bột mẫu khô tuyệt đối cho vào ống eppendort (2ml), cho 
vào 1,5ml dung dịch đệm chiết photphat citrat (pH = 10), lắc đều trong 10 phút, 
để ống nghiệm ở 4oC trong vòng 24 giờ.
 (2) Li tâm lạnh 12.000 vòng/phút ở 4 oC trong thời gian 30 phút, rồi thu 
dịch để làm thí nghiệm. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
 Dịch chiết được định mức lên 5 ml bằng dung dịch đệm phosphat citrat 
(pH=10) và đo hấp thụ trên máy UV vis Cintra ở bước sóng 750nm với thuốc 
thử foling.
 Hàm lượng protein tan được tính theo công thức:
 A.HSPL 
 X(%) 100% 
 M
 Trong đó: X: Hàm lượng protein (% khối lượng khô)
 A: Nồng độ đo được trên máy quang phổ (mg/ml) 
 HSPL: Hệ số pha loãng
 M: Khối lượng mẫu đem phân tích (mg)
 • Xác định hàm lượng đường tan theo phương pháp vi phân tích được mô 
tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu [4].
 Đường tan trong hạt nảy mầm được chiết bằng nước cất, để ở 4 0C trong 24 
giờ. Sau đó li tâm ở 4 oC với vận tốc 12000 vòng/phút trong thời gian 30 phút. 
Thu dịch để phân tích, tiến hành lặp lại 3 lần.
 Hàm lượng đường tan được tính theo công thức:
 a b HSPL
 X 100 %
 m
Trong đó: X: hàm lượng đường tan (%) b: số ml dịch chiết 
 HSPL: hệ số pha loãng m: khối lượng mẫu (mg) 
 a: nồng độ đo được trên máy (mg/ml )
 6 - Phương pháp xác định hàm lượng diệp lục: Hàm lượng diệp lục được 
mô tả trong sổ tay phân tích đất, nước, phân bón cây trồng (1998) [31].
Các bước tiến hành như sau:
 + Cân 0,1 g lá nghiền trong cồn ethanol 96%
 + Li tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi
 + Dịch thu được đem pha loãng 10ml rồi đo quang phổ hấp thụ trên máy 
quang phổ UV Visible ở bước sóng 665 nm và 649 nm.
 + Hàm lượng diệp lục (mg/g lá tươi) được tính theo công thức:
 C V  n
 A 
 P 1000
 Trong đó: C: nồng độ diệp tính ra (mg/l) (gồm có Ca, Cb, Ca+b) 
 Ca (mg/l) = 13,70. E665 – 5,76. E649
 Cb (mg/l) = 25,80. E649 – 7,60. E665 
 Ca+b (mg/l) = 6,10. E665 + 20,04. E649
 P: Khối lượng mẫu (g)
 V: Thể tích sắc tố rút được (ml)
7.3.2.3. Phương pháp sinh học phân tử
7.3.2.3.1. Tách chiết DNA tổng số từ lá lúa
 Quy trình tách chiết và làm sạch DNA tổng số từ lá lúa dựa theo phương 
pháp của Foolad và cs (1995) có cải tiến [41].
 - Tiến hành: Hạt lúa R3 của một số dòng từ thế hệ R 2 được bóc vỏ và khử 
trùng, cấy hạt trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 3% saccharose, 0,8% agar, 
mật độ cấy 20 hạt/ bình. Sau 10 ngày thu lá, bảo quản ở tủ lạnh sâu -85 0C. DNA 
tách từ lá non của lúa được thực hiện theo các bước sau:
(1) Phá vỡ tế bào bằng cách nghiền nhanh 0,2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành 
dạng bột mịn bằng chày cối sứ.
(2) Cho 1,5 ml đệm chiết CTAB (CTAB 2,5%+100ml Tris - HCl pH=8 + 200 
ml EDTA + NaCl 1,4mg), ủ trong 30 phút ở bể ổn nhiệt (650C).
(3) Bổ sung 1,0ml hỗn dịch chloroform: isoamyl (24 : 1), lắc nhẹ trong 20 phút.
(4) Li tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu dịch nổi trên.
(5) Tủa dịch nổi bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1).
(6) Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi.
 8 Thành phần phản ứng của phản ứng PCR nhân đoạn gen osDREB1F ở lúa 
được trình bày ở bảng 2.4
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng của phản ứng PCR nhân đoạn gen osDREB1F 
ở lúa
 1 Thành phần Thể tích(µl)
 2 Nước khử ion vô trùng 12,85
 3 Buffer 10X 2,5
 4 dNTP (25mM) 2,5
 5 Mg2+ (25mM) 2,5
 6 DREB1F (10mM) 1
 7 DREB1R (10mM) 1
 8 Taq- polymerase(5U/µl) 0.15
 9 Khuôn DNA(100ng/µl) 2
 10 Tổng 25
 Chu kỳ nhiệt: 94 oC: 3 phút; lặp lại 30 chu kỳ (94 oC- 1 phút, 56oC- 1 
phút, 72oC- 1 phút 30 giây); 72oC- 10 phút; 4oC - ∞. Sau chu kỳ cuối cùng, 
chuyển về nhiệt độ 4oC bảo quản trước khi tinh sạch, bảo quản ở -20oC.
 Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR
 Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kít của Hãng Bioneer (AccuPrep 
PCR Purification Kít) theo qui trình như sau:
 - Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm
 - Bổ sung đệm hòa tan (GB - Gel binding buffer) theo tỉ lệ: V mẫu : VGB: V 
 o
Izopropanol = 1 : 3 : 1 (1µl tương ứng với 1mg mẫu). Ủ ở 60 trong 10 phút, sau khi 
gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn.
 - Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột Qiaquick spin colum, ly tâm 
13000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
 10 được gắn nối, tiếp xúc với tế bào thích ứng nhằm tạo điều kiện cho chúng xuyên 
qua màng vào trong nguyên sinh chất. Khi đã được chuyển nạp, plasmid (có thể 
tái tổ hợp hoặc không) sẽ cùng nhân lên cùng với tế bào chủ khi nuôi trong môi 
trường dinh dưỡng thích hợp.
 Quy trình biến nạp như sau:
 Bổ sung 7µl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến Ecoli DH 5α 
và trộn nhẹ, rồi ủ trong đá lạnh (0 – 4 oC) trong 30 phút, cho plasmid xuyên qua 
màng chuyển nạp vào tế bào. Sau đó hỗn hợp được xử lý sốc nhiệt ở 42 oC trong 
1 phút và ngay lập tức chuyển vào ủ trên đá lạnh trong 5 phút. Bổ sung 400µl 
môi trường LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) vào hỗn hợp rồi đem hỗn hợp 
nuôi lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 37 oC để vi khuẩn tái tổ hợp nhân lên trong 
vài chu kỳ sinh trưởng và phát triển. Sử dụng que cấy trải, trải 100 - 150µl dịch 
khuẩn lên đĩa môi trường LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có chứa 
kháng sinh ampicillin (100mg/l), X-gal (40mg/l) và IPTG (100µM). Ủ đĩa ở 
37oC trong 16 - 20 giờ.
 Chọn dòng bằng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc
 Sau khi biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli, chọn lọc 
trên môi trường thạch có chứa 100mg/l ampicillin, X-gal (4mg/l), IPTG 
(100μM), ủ đĩa ở 37 0C trong 16 - 20 giờ sẽ thu được các khuẩn lạc xanh trắng. 
Chọn 10 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để tiến hành phản ứng colony-PCR 
với cặp mồi pUC18(có trình tự bắt cặp mồi trên vector và cách nhau khoảng 
0,2kb). Thành phần phản ứng colony-PCR tương tự như trong phản ứng PCR 
chỉ khác cặp mồi sử dụng và mẫu DNA thay bằng khuẩn lạc. Điện di sản phẩm 
colony-PCR trên gel agarose 1% để chọn ra các khuẩn lạc chứa plasmit như 
mong muốn. Đồng thời, nuôi những khuẩn lạc này trong 3 ml môi trường LB 
lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l nhằm mục đích tách plasmit.
 Tách DNA plasmid tái tổ hợp
 - Tách plasmit được sử dụng đệm chiết TELT: Tris-HCl 0,5M, pH=7,5; 
EDTA 0,5M ,pH=8,0; LiCl 1M ; Trion X-100.
 12